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| 1 | 实时荧光定量PCR技术及其应用显示文摘实时荧光定量PCR技术是一种多色荧光检测核酸定量技术 ,该文简要介绍实时荧光定量PCR技术的原理及其应用。 | 欧阳松应 杨冬 欧阳红生 马鹤雯 | 2004 | 生命的化学2004，24，1： | 156 |
| 2 | 柑桔黄龙病的常规PCR及荧光定量PCR检测显示文摘目的为柑桔黄龙病的早期诊断和寄主体内病原菌的动态监测提供一种稳定、可靠的检验检疫技术。方法利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因rplJ/rplL设计了2对PCR引物CQULA03F/CQULA03R、CQULA04F/CQULA04R和1条TaqMan探针CQULAP1,以此为基础建立了常规PCR和TaqMan探针法、SYBRGreenI荧光染料法两种荧光定量PCR(共3种)反应体系;确定了3种体系各自的检测灵敏度、特异性和准确性,据此对3种体系进行了比较;从2004年7月到2005年5月还利用常规PCR和TaqMan探针荧光定量PCR体系完成了对柑桔黄龙病病原菌在寄主体内的周年变化的动态监测。结果两种荧光定量PCR方法的灵敏度比常规PCR高出至少2~3个数量级,而TaqMan探针法由于使用了杂交探针,其特异性尤其可靠,另外两种定量PCR较小的产物片段使得它们具有更好的稳定性,加上荧光定量PCR方法本身受污染可能性小、操作简便等固有优势,使得前者更适合于柑桔黄龙病的检测。结论本研究建立的2种荧光定量PCR方法可以为柑桔黄龙病的病害早期诊断以及柑桔黄龙病病原菌近缘种的甄别提供准确、灵敏、快速的检验检疫技术。 | 胡浩 殷幼平 张利平 赵云 夏玉先 王中康 覃健 | 2006 | 中国农业科学2006，39，12： | 57 |
| 3 | 实时荧光定量PCR及其在微生物生态学中的应用显示文摘定量描述微生物群落的组成,在微生物生态学的许多研究领域都是非常重要的。然而由于可培养技术的局限性,定量描述微生物群落成为比较困难的事情。最近包括PCR技术在内的分子生物学技术为人们提供了有力的工具,使对微生物群落的分布、丰度等有了进一步的了解。实时荧光定量PCR技术作为核酸定量检测技术,自从发明以来在微生物生态学研究中逐渐得到了广泛的应用。从微生物生态学角度,综述了实时荧光定量PCR技术的原理、发展、优缺点及其在微生物生态学研究中的应用与研究进展,并探讨了实时荧光定量PCR技术的发展和应用前景。 | 张晶 张惠文 张成刚 | 2005 | 生态学报2005，25，6： | 43 |
| 4 | 利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究显示文摘转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素,因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键.利用高通量、快速、灵敏的SYBR GreenⅠ荧光定量实时PCR法,检测了转大麦烟酰胺合成酶基因(NAS1)水稻中外源基因拷贝数.以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为水稻的内源参照基因,通过梯度稀释法,分别获得了NAS1和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线,相关系数分别为0.99976和0.99571,相关性高.通过目的基因NAS1和水稻内源参照基因SPS起始模板数的比较,获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数,在8株转基因株系中,1株为假阳性,1株拷贝数为1,3株拷贝数为2,其余3株拷贝数分别为3、4和7,而阴性对照拷贝数为0.这种方法快速、简便、准确,可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择. | 王育花 赵森 陈芬 肖国樱 | 2007 | 生命科学研究2007，11，4： | 48 |
| 5 | 虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测显示文摘根据Gen Bank中公布的虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)(EHP)SSU r DNA序列设计1对特异性引物,建立并优化了EHP的SYBR Green I实时荧光定量PCR(q PCR)检测方法。结果显示,该方法在60℃的退火温度时扩增效果最好,产物的熔解曲线为1个单峰,构建的方法对8.3×101–8.3×108 copies/μl的EHP SSU r DNA片段的检测响应具有良好的线性关系,扩增产物阈值循环数(Ct)与模板起始量的对数[log(Sq)]的关系为Ct=–3.369 log(Sq)+39.364(R2=0.992),扩增效率为98.1%,检测灵敏度下限为8.3×101 copies/μl,在线性范围内具有良好的组内和组间重复性。对实际样品的检测表明该方法比已报道的套式PCR的检测灵敏度约高4倍。利用本方法对采集自江苏、海南和山东的3批凡纳滨对虾样品的肝胰腺组织DNA(Hp DNA)中的EHP SSU r DNA进行了q PCR检测,结果显示,EHP的载量指数与对虾生长速率呈负相关关系,肝胰腺中EHP载量在103 copies/(ng Hp DNA)时代表了较高的风险水平。本研究建立的q PCR方法具有特异、灵敏、快速、定量的优点,所建立的方法及检测数据可为EHP的防控提供技术参考。 | 刘珍 张庆利 万晓媛 马芳 黄倢 | 2016 | 渔业科学进展2016，37，2： | 45 |
| 6 | 四步法消除SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响显示文摘为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂的 (5s)恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四步法 .PDs的Tm 通常高于 72℃ ,但低于扩增产物的Tm .将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时 ,四步法能够有效地消除PDs的影响 .对三步法和四步法SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR进行了比较 ,发现三步法根本不能用于RNA的实时定量 ,而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量 .选择Tm 值尽可能小的引物 ,使PDs与扩增产物Tm 值之间有足够的差距 ,将更有利于四步法的应用 。 | 张驰宇 张高红 杨敏 贲昆龙 | 2004 | 中国生物化学与分子生物学报2004，20，3： | 47 |
| 7 | SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立显示文摘目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。 | 丛喆 李兆忠 魏强 许琰 蒋虹 佟巍 卢圣栋 涂新明 | 2006 | 中国实验动物学报2006，14，4： | 29 |
| 8 | 实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用显示文摘实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸定性、定量检测、分析技术。随着转基因产品大规模商业化,转基因生物的环境安全和食用安全性问题引起了全球范围内广泛的争论和关注。实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及PCR反应后不需电泳检测等优点,使RQ-PCR逐步成为转基因检测的重要工具。 | 敖金霞 高学军 仇有文 郭士成 | 2009 | 东北农业大学学报2009，40，6： | 29 |
| 9 | 抗草甘膦转基因大豆PCR定量检测研究显示文摘试验建立大豆中转基因成分的定量测定方法。采用双链DNASYBRGreenI结合染料实时荧光定量PCR技术,扩增编码大豆凝集素的内参照基因lec和抗草甘膦转基因大豆中的外源花椰菜花叶病毒CaMV35s基因,绘制2种基因扩增的循环数拷贝数标准曲线图,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量;并作重现性和熔解曲线分析。结果表明,lec和CaMV35s基因标准曲线方程线性好,R2值分别达到0.9997和0.9992。不同转基因含量的标准及模拟大豆样品定量显示,实测值与实际值接近,相对偏差5%~11%。SYBRGreenI实时定量PCR方法可用于定量测定大豆中转基因品种的含量。 | 朱元招 尹靖东 李德发 王凤来 | 2005 | 中国农业大学学报2005，10，3： | 27 |
| 10 | 大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测显示文摘为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRGreenⅠ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。 | 胡慧 陈雅君 段志刚 孟振北 彭新然 张龙现 崔保安 王亚宾 | 2011 | 食品科学2011，32，12： | 28 |
| 11 | 坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立显示文摘【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99以上,检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。 | 于春梅 刁有祥 唐熠 崔京腾 高绪慧 张颖 鞠小军 武利利 | 2012 | 中国农业科学2012，45，21： | 27 |
| 12 | 基因宏阵列和荧光定量PCR方法对西瓜枯萎病害土壤中尖孢镰刀菌的快速检测和定量显示文摘采用基因宏阵列(Macroarray)和荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法,对引起西瓜枯萎病害的病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)进行了快速监测和快速绝对定量,并且对实验条件进行了优化和摸索。结果显示,在西瓜枯萎病害发病较为严重的处理N-+P-和N-+P+的根际土壤中,Macroarray检测到强烈的阳性信号,表明尖孢镰刀菌的大量存在,同时荧光定量PCR的结果也表明在这两个处理的根际土壤中尖孢镰刀菌数量最多,分别为每g土壤8.89×105和2.24×105个拷贝数;而在未发生枯萎病害的处理N++P-和N++P+中,Macroarray未检测到阳性信号,根际土壤中尖孢镰刀菌数量分别为每g土壤6.23×103和3.28×103个拷贝数;而四个处理的土体土壤中尖孢镰刀菌的数量均维持在每g土壤102~103个拷贝数,Macroarray未检测到阳性信号。与传统检测方法如病原菌的分离培养、平板稀释计数等相比,上述分子生物学方法对病原真菌的检测和定量更为准确快速、省时省力。 | 赵爽 罗佳 凌宁 徐大兵 朗娇娇 胡江 沈其荣 | 2010 | 土壤学报2010，47，4： | 26 |
| 13 | 荧光定量RT-PCR法检测运输应激猪热休克蛋白mRNA转录水平显示文摘目的探讨应激时热休克蛋白mRNA转录水平的变化。方法根据HSP90、HSP70和GAPDHmRNA序列,设计并合成引物,将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,体外转录出RNA,梯度稀释作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测,建立了一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台,并用于检测长途运输猪心脏和肝脏中HSP70及HSP90mRNA转录水平的改变。结果经1、2、4、6和10h的运输应激后,组织中HSP70mRNA的转录水平随着运输应激时间的延长一直呈现出上升的趋势,运输应激到10h时HSP70mRNA的转录水平升到最高,肝脏和心脏组织中HSP70mRNA的转录水平分别为对照组的2.5和4.1倍;HSP90mRNA的转录水平则随着运输应激时间的延长呈下降趋势。结论运输应激可以影响HSPmRNA转录水平的变化,并且对不同家族的HSPmRNA转录水平的影响不同;HSP70mRNA的转录水平有望成为猪运输应激的判定指标之一。 | 李玉保 鲍恩东 王志亮 赵茹茜 | 2006 | 中国农业科学2006，39，1： | 23 |
| 14 | 实时荧光定量PCR方法检测大肠杆菌O157:H7显示文摘针对大肠杆菌(Escherichiacoli)O157:H7的致病基因eae设计了特异性引物,并用荧光染料SYBRGreenⅠ进行了实时定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)。熔解曲线显示产物特异性较强,无非目的条带和二聚体产生。并对反应程序进行了优化,确定了最佳的反应程序,最终在合适的模板浓度内得出了标准曲线。结果显示Real-timePCR比普通PCR灵敏1000倍。 | 陈思 黄昆仑 许文涛 李媛 罗云波 | 2006 | 农业生物技术学报2006，14，5： | 23 |
| 15 | 猪流行性腹泻病毒SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立显示文摘参考GenBank上登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)株的ORF3基因序列保守型片段设计特异性引物,建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。在4.32×102~4.22×107copies范围内,它有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异峰,无引物二聚体,熔解温度为82.23℃±0.19℃。它对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,表明其特异性强。该方法的组内变异系数为0.05%~0.87%,组间变异系数为0.32%~1.24%,重复性好。结果表明,建立的SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR为PEDV早期感染的诊断及定量分析提供了新的方法。 | 修金生 周伦江 陈如敬 王隆柏 陈小权 | 2012 | 中国兽医科学2012，42，2： | 23 |
| 16 | SYBR Green实时荧光PCR检测食品中鲨鱼源性成分真实性方法的建立显示文摘为确保鲨鱼产品的真实性,作者研究建立了食品中鲨鱼源性成分的SYBR Green实时荧光PCR鉴定方法。运用建立的SYBR Green实时荧光PCR方法对9种鲨鱼及48种常见非鲨鱼类动植物样品进行检测,9种鲨鱼样品均出现扩增曲线,且熔解曲线在(84±1.5)℃内出现峰值;其他非鲨鱼样品中均未出现扩增曲线,熔解曲线在(84±1.5)℃也未出现峰值。该检测方法的检测限为0.000 1 ng/μL鲨鱼DNA和质量分数0.01%狗鲨肉粉。运用建立的方法对20种常见的鲨鱼产品进行PCR检测,除仿鱼翅和鲨鱼肝油外所有产品中均能检测出鲨鱼成分。结果表明,该检测方法特异性强,灵敏度高,能够用于食品中鲨鱼源性成分的真实性鉴别。 | 郭云霞 张舒亚 谌鸿超 任硕 黄文胜 包建强 陈颖 | 2012 | 食品与生物技术学报2012，31，12： | 23 |
| 17 | Ⅰ群禽腺病毒SYBR GreenⅠ荧光PCR检测方法的建立显示文摘根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒六邻体基因的保守序列设计了1对引物,建立了检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的SYBR GreenⅠ荧光PCR方法。用Ⅰ群禽腺病毒阳性样品进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示。该方法可检测到每个反应相当于1×10^2个拷贝的标准品DNA,与鸡减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、传染性腔上囊炎病毒和传染性支气管炎病毒等非Ⅰ群禽腺病毒不发生交叉反应,具有良好的重复性。对保存的3份Ⅰ群禽腺病毒的细胞培养物进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为1×10^6~1×10^8拷贝/μL。表明.建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上Ⅰ群禽腺病毒感染的检测。 | 文艳玲 谢芝勋 王莹 谢丽基 | 2008 | 中国兽医科学2008，38，9： | 21 |
| 18 | 鸭坦布苏病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量检测方法的建立显示文摘根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DFV)NS5基因序列特征设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR,RRT-PCR),该方法检测DFV NS5基因2.74×103~2.74×107拷贝/μL反应范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(86.23±0.18)℃,对禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽1型副黏病毒、鸭减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.52%~1.48%,组间变异系数0.71%~2.21%。检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4h。 | 万春和 朱海侠 施少华 黄瑜 程龙飞 傅光华 陈红梅 | 2013 | 中国兽医学报2013，33，7： | 21 |
| 19 | SYBR Green I实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用显示文摘【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一,早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂,而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测,研究旨在建立小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的SYBR Green I实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin序列,设计1对特异性引物,建立并优化SYBR Green I real-time PCR反应体系,利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌(R.solani)、双核丝核菌AG-A和AG-F菌株、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢(Fusarium pseudograminearum)和禾谷镰孢(F.graminearum)等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝DNA进行普通PCR和real-time PCR特异性检测,并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强,普通PCR检测结果仅小麦纹枯病菌DNA有扩增条带。Real-time检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰,对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通PCR检测的灵敏度为6.5×103copies/μL,real-time PCR的灵敏度可达到6.5×102copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品,构建的real-time PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,熔解曲线的吸收峰单一,相关系数为0.997,扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行real-time PCR检测,结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于real-time PCR技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。 | 孙炳剑 陈清清 袁虹霞 施艳 李洪连 | 2015 | 中国农业科学2015，48，1： | 21 |
| 20 | 禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立显示文摘为建立禽呼肠孤病毒(ARV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切,得到线性化转录模板DNA,将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板,用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物,以体外转录的RNA作为标准品,应用SYBRGreenI染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,比常规的RT-PCR敏感1×10^3倍,可检测到5.2×10^2个拷贝的标准品RNA,与NDV、IBDV、MG均不反应;从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒,病毒含量为1×10^5~1×10^7个拷贝/μL.表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于ARV的检测。 | 童桂香 谢芝勋 黄琦 文艳玲 谢丽基 庞耀珊 刘加波 邓显文 | 2007 | 中国兽医科学2007，37，9： | 19 |
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